Künstliche Replikation der DNA (PCR-Methode) - inkl. Vergleich zur natürlichen
Um selbst bei geringer DNA-Menge einen genetischen Fingerabdruck zu erzeugen, ist die künstliche Reproduktion von DNA nötig. Das Verfahren hierzu ist der natürlichen Replikation nachempfunden und heißt Polymerasekettenreaktion (PCR), wobei der Prozess der Replikation mehrfach (20-50 mal) wiederholt wird. Das Verfahren läuft mittlerweile vollautomatisch in Thermocyclern ab und besteht aus drei Schritten.
- Denaturieren
- Die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen der Stränge werden bei 90-95°C denaturiert, sodass aus den Doppelsträngen der DNA Einzelstränge entstehen.
- Primerhybridisierung (primer annealing)
- Bei 50-60°C binden zugegebene synthetische Primer (aus RNA-Nukleotiden) an die Einzelstränge, welche als Ansatzpunkt für die Polymerase dienen.
- Polymerisieren
- Bei 70-75°C erreicht die hinzugefügte Taq-Polymerase (von einem Bakterium aus heißen Quellen) ihr Temperaturoptimum und synthetisiert den komplementären DNA-Strang mithilfe der in der Lösung befindlichen DNA-Nukleotide.
Nur Sequenzen mit bekannter Primersequenz und begrenzter Länge können repliziert werden.
Vergleich zur natürlichen Replikation
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künstlich |
natürlich |
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ganze Teilung des Doppelstrangs durch Denaturierung der Wasserstoffbrücken bei 90-95°C |
Teilung nach und nach durch Helicase |
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da die gesamte Teilung vor der Synthese geschieht, können beide Stränge kontinuierlich synthetisiert werden, keine Fragmentierung, keine Ligasen |
durch die Teilung nach und nach gibt es einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Strang (Arbeitsweise der Polymerase an einem Strang nicht kontinuierlich) → Okazaki Fragmente → Ligase nötig |
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nur Sequenzen mit bekannten Primern können synthetisiert werden |
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Taq-Polymerase (bestimmte DNA-Polymerase) |
DNA-Polymerase |
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die Primer werden nicht entfernt / ersetzt |
die Ribonuklease H entfernt die Primer, eine spezielle DNA-Polymerase fügt DNA-Nukleotide ein |
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temperaturgeregelt, Ergänzung zufälliger |
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